4.1 引言

    蛋白质聚集和错误折叠是蛋白质治疗剂生产中普遍存在的问题。细菌宿主是重组蛋白质的高效表达系统,但是细菌表达宿主内蛋白质产物的过表达常会产生大量聚集的、无活性的重组蛋白质包涵体。其他利用哺乳动物细胞、真菌或酵......查看详细>>

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4.2.1 增溶

    在从包涵体中复性蛋白质之前,必须首先使聚集体和包涵体溶解和变性。增溶中最常用的变性剂为尿素和盐酸胍。这两种促溶剂均为小分子,易于结合蛋白质,进而打破维持蛋白质结构的分子内和分子间作用力[5,6]。除尿素和盐酸胍外......查看详细>>

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4.2.2 复性

    当蛋白质完全溶解后,将其转移至另一热力学上有利于天然构象的溶液中来诱导复性。最常见的是通过降低促溶剂的浓度(采用稀释或透析操作)至非变性水平来诱导蛋白质复性。当变性剂浓度下降至足够低时,氨基酸之间的分子内作用......查看详细>>

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4.2.3 二硫键

    伴随着热力学推动的蛋白质三维结构的折叠,二硫键也必须正确形成,才能获得天然构象的蛋白质。尽管复性中形成正确二硫键的统计学概率比较低[10],但实际上通常可以以合理的效率形成天然二硫键。因此,我们推断,蛋白质结构的折......查看详细>>

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4.2.4 复性添加剂

    蛋白质的稳定性和溶解性与能否成功提高复性产率密切相关。如果天然蛋白质在选择的复性缓冲液中不能溶解,则复性不会发生。决定了使用何种能够促进溶解的复性缓冲液后,还需了解可改善天然蛋白质的稳定性和溶解性的缓冲液配......查看详细>>

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4.3.1 决定是否复性

    在开始蛋白质复性之前,企业应该考虑一个策略问题,即选择从包涵体中复性蛋白质还是考虑更换表达宿主生产正确折叠蛋白质。细胞培养开发团队的特殊经验可对这一决定加以指导。而且,哺乳动物细胞中表达的完全糖基化产物通常......查看详细>>

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4.3.2 有无纯化的蛋白质?

    如果计划开发复性过程,使用纯化蛋白质将对过程开发具有很大的指导作用。如果可以获得纯化蛋白质,我们建议同时建立其在尿素和盐酸胍中的展开曲线。文献中可找到几篇有关建立和解释展开曲线的良好的实用指南[16,17]。一般通......查看详细>>

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4.3.3 目标蛋白质是否含有二硫键?

    二硫键的存在对复性过程的开发增加了一定程度的复杂性。前文曾经提及,增溶阶段二硫键必须被还原,而复性阶段需被氧化。因此,对具有或没有二硫键的蛋白质,我们提供不同的建议。4.3.3.1无二硫键蛋白质的复性当复性无二硫键的蛋......查看详细>>

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4.3.4 复性的分析

    测定复性是否成功的分析方法应根据复性结果加以选择。不可溶的聚集体可以通过光散射技术(～320nm波长处紫外吸收或荧光散射)检测。不可溶的产物也可以通过离心沉降,然后再次溶解并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(S......查看详细>>

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4.3.5 复性结果和提高复性产率的策略

    首次复性筛选完成后,可能会观察到三个主要的结果:不可溶产物、可溶但错误折叠产物和含有可测定天然蛋白质的可溶性产物。根据首次复性筛选实验中获得的是可溶性还是不可溶性产物,改善复性的后续实验设计策略的重点有所不......查看详细>>

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