1.1 引言

    在新开发或改进生物催化剂时,通常要进行微生物采集,测定酶突变体表达文库或者宏基因组文库的酶活性,高通量活性筛选是关键步骤之一。理想情况下,筛选是在操作条件下的可靠反应,反应进程用分析仪器如高效液相色谱仪、气相色......查看详细>>

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1.2.1 手性荧光醇脱氢酶(ADH)底物

    醇脱氢酶将NAD(P)+转化为NAD(P),在340nm处使用紫外或荧光能检测到这一反应。然而,信号往往会被污染物或其他检测组分所掩盖,如检测是在全细胞中或存在其他发色团时,还原型辅因子非常不稳定。信号稳定在间接检测中也是一个问题......查看详细>>

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1.2.2 荧光醛缩酶探针

    20世纪90年代,醛缩酶催化抗体的发现使得人们在筛选非天然醛缩酶型底物生物转化醛醇缩合反应方面的兴趣日增[6～8]。上面提到的醇脱氢酶(ADH)检测可以在丁间醛醇底物形式上修饰,例如底物6通过逆丁间醛醇/顺序β-消除反应来检测逆......查看详细>>

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1.2.3 转醛醇酶和转酮醇酶

    图式1-3转醛醇酶和转酮醇酶的荧光底物coum:图中化合物10的缩写转醛醇酶10～12(图式1-3)的相关体系后来被开发[12]。各种转醛醇酶的戊酮型/己酮型立体异构性可以通过荧光立体异构底物对11/12检测。然而与天然底物相比,这些底物的转......查看详细>>

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1.2.4 烯醇化酶探针

    醛缩酶类生物催化剂通常希望用来催化酮供体的烯醇化。然而通过荧光直接检测烯醇化作用是不可能的。最近发现,二羟基丙酮香豆醚14可以作为在水缓冲溶液中的一种荧光烯醇化探针(图式1-4)[16]。通过伞形酮的β-消除反应形成烯醇......查看详细>>

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1.3.1 固体支持物的检测

    伞形酮酯或硝基苯酚酯作为脂肪酶底物的缺点在于它们的低水溶性和高的非特异性。因为脂肪酶是界面酶,因此一直在进行检测设计的探索:这些底物在酶溶液中是稳定的,且在高表面积的材料上不溶。实现这个设计最好是使用浸渍硅......查看详细>>

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1.3.2 高碘酸盐的夹子-O底物

    夹子-O底物是水解酶荧光和显色底物的最可靠种类之一,特别是脂肪酶(例如19)[30～32]。这些底物依据于双间接释放机制,1,2-伯二醇产物与高碘酸钠形成的不稳定的醛或酮连续开环,产生荧光信号(例如21),经过β-消除反应释放伞形酮5或硝......查看详细>>

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1.3.3 荧光氰醇酯和羟基酮酯

    在脂肪酶和酯酶底物的酯功能上,通常使用脂肪族醇而不是酸性苯酚类化合物,这是获取这些酶选择性探针的关键。在这种情况下,利用伯醇产物的氧化分解即可得到解决。荧光氰醇和羟基酮能自发反应生成荧光苯酚,接着是连续β-消除......查看详细>>

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1.3.4 荧光乙酰氧基甲基醚类

    伞形酮能与多种脂肪酸氯甲基酯烷基化反应,产生乙酰氧甲基醚,且得率不错(例27)[38]。这些底物在缓冲液中经过脂肪酶/酯酶-催化水解反应形成伞形酮(图式1-9)[39]。其机制可能涉及一个不稳定的半缩醛中间体,它能自发反应生成甲醛和......查看详细>>

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1.3.5 FRET-脂肪酶探针

    FRET(荧光或Förster共振能量转移)是最基本的原则之一,用来设计裂解反应的荧光底物和众所周知的蛋白酶和脂肪酶底物。尽管双重标记强烈影响反应活性,但应用脂肪酶FRET底物仍然得到了研究。围绕1,2-二醇单酯功能的各种变量调查......查看详细>>

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