小菜蛾Cactus基因的克隆及表达模式研究

摘要： Cactus是昆虫NF-κB信号通路的核转录抑制因子(Inhibitor of nuclear transcription factor,IκB),可通过蛋白质间的相互作用与Toll信号通路中核转录因子(Nuclear transcription factor,NF-κB)Dorsal及Dif结合,从而调控抗菌肽基因的表达。为阐明Cactus在小菜蛾Toll信号通路中的功能,本研究利用RT-PCR结合RACE技术获得了小菜蛾Cactus基因的c DNA全长序列,命名为PxCactus(Gen Bank登录号:KY828920),其c DNA全长为1 868 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列1 053 bp,编码350 aa。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对PxCactus的时空表达差异性检测表明,PxCactus基因在小菜蛾不同的发育阶段都有表达,其中2龄幼虫表达量最低,4龄幼虫表达量最高;PxCactus在健康的4龄幼虫不同组织都有表达,其中在脂肪体中的表达量显著高于其它组织;在脂肪体中PxCactus的表达可以被Bacillus thuringiensis和Serratia marcescens强烈诱导表达,而Metarhizium anisopliae抑制了PxCactus的表达。为了获得PxCactus的多克隆抗体,本实验构建了原核表达质粒p GEX-4T-PxCactus,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了融合蛋白GST-PxCactus,利用GST亲和柱纯化了融合蛋白,并免疫日本大耳兔制备了PxCactus多克隆抗体anti-PxCactus。ELISA和Western blot检测结果表明anti-PxCactus和PxCactus蛋白呈高效结合反应,表明已经成功制备的多克隆抗体;并利用Western blot检测到了小菜蛾脂肪体组织中的Cactus蛋白的表达。本研究成功克隆PxCactus基因及制备其多克隆抗体,为下一步研究PxCactus调控Toll信号传导,从而调控抗菌肽的表达奠定了分子基础。 （共12页）