应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒e抗原调节基因

摘要： 目的　筛选与克隆HBeAg激活基因 ,了解其在体内的凋节功能线索。方法　以HBeAg表达质粒pcDNA3 .1(-) HBeAg转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR) ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染人肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果　成功构建人HBeAg激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 40个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 2 0 0～ 80 0bp插入片段。对插入片段测序 ,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列 ,结果共获得 12种编码基因 ,包括 11种已知基因和 1种未知基因。结论　筛选到的cDNA全长序列 ,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因 ,推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索 ,尚需进一步的实验证明。 ... （共4页）